Domowa hodowla roślin owadożernych in vitro

Rozmnażanie i hodowla roślin in vitro jest powszechnie określana terminem mikrorozmnażania. Nazwa pochodzi od tego, że do wprowadzania rośliny do warunków in vitro używa się najczęściej mikroskopijnych ich części, z których następnie można otrzymać miliony nowych roślin.

Mikrorozmnażanie pozwala na otrzymanie dużej ilości genetycznie identycznych roślin w stosunkowo krótkim czasie. Hodowlę prowadzi się  w warunkach sterylnych, na odpowiednio skomponowanych pożywkach, zawierających wszystkie niezbędne do wzrostu składniki organiczne i nieorganiczne. Często używa się również hormonów roślinnych i innych substancji chemicznych do kontrolowania wzrostu. Rośliny hodowane w warunkach in vitro są wolne od patogenów i szkodników, co przy relatywnie niskim koszcie ich produkcji stanowi o dużej konkurencyjności tej metody względem tradycyjnych metod hodowli. Dla nas najważniejsza jest możliwość rozmnożenia roślin w szybkim czasie, używając do tego jedynie niewielkiej części roślinki czyli tzw. eksplantatu.

Bogata pożywka na której rosną rośliny przyspiesza ich wzrost nawet dziesięciokrotnie. Odpowiednie hormony powodują dzielenie się roślin, które są przekładane (pasażowane) na nowe pożywki, co co daje możliwość ich dalszego podziału i rozwoju. Wymienione czynności są powtarzane cyklicznie aż do momentu uzyskania pożądanej ilości roślin. W ciągu roku z małego fragmentu można uzyskać nawet od miliona do 10 milionów roślin. Tak wielką ilość roślinek można zmieścić na bardzo małej powierzchni rzędu kilku metrów kwadratowych, co jest dodatkową zaletą tej techniki.

Mimo pozornej niedostępności procesu dla zwykłych śmiertelników, ze spokojem można prowadzić mikrorozmnażanie roślin we własnej kuchni. Będzie to wymagało wielu nieudanych prób i wiele kreatywności jednak efekty które można osiągnąć są tego warte ;) .

O hodowli

Hodowla in vitro jest prowadzona w warunkach jałowych, na specjalnie przygotowanych pożywkach. Hodowane mogą być całe rośliny, jak również ich organy, tkanki bądź komórki. Najbardziej istotnym i trudnym do utrzymania w warunkach amatorskich czynnikiem jest sterylność pożywek i hodowanych kultur (kultury tkankowe jest to dość powszechna nazwa na rośliny hodowane metodą in vitro). Pożywka na której rosną rośliny jest bogata w sole mineralne i składniki organiczne wśród których najwięcej jest cukrów. Ponieważ rośliny (a raczej fragmenty roślin)  w kulturach in vitro nie przeprowadzają fotosyntezy musimy sami zapewnić im pokarm w postaci cukrów. Niestety, środowisko takie bardzo sprzyja rozwojowi niepożądanych dla nas grzybów, bakterii i glonów. W ciągu kilku dni nieproszeni goście potrafią zarosnąć całą pożywkę, zabijając rośliny. W związku z tym podczas zakładania kultur tkankowych należy zadbać o ich całkowitą sterylność.  Osiąga się to pracując w wolnej od zarodników grzybów i bakterii atmosferze utworzonej w komorze laminarnej, bądź w tzw. „clean-boxie” czyli kartoniku spryskanym wewnątrz alkoholem w najprostszej jego postaci. Dodatkowo sterylizowane są pożywki i tak samo fragmenty roślin z których zakładamy nową kulturę (tzw. eksplantaty). Istnieją również dodatki do pożywek takie jak jak PPM (inhibitor enzymów oddechowych mikroorganizmów), które znacznie ograniczają możliwości wzrostu nieproszonych gości, będąc najlepszym przyjacielem w domowym mikro rozmnażaniu.

Jak to właściwie działa?

Do założenia hodowli in vitro potrzebna jest minimum jedna komórka roślinna która nie zatraciła zdolności do podziałów. W związku z tym zdrewniałe i stare tkanki, które zatraciły zdolność do podziału, bądź ich podział jest wolny i znacznie zahamowany, nie nadają się do założenia kultury. Zazwyczaj używa się całkiem sporego fragmentu rośliny, o dużym zagęszczeniu komórek zdolnych do podziałów. Może być to np. liść, pęd kwiatowy, uśpiony pęd boczny bądź merystem. Cały proces namnażania można podzielić na kilka etapów:

1. Wprowadzenie tkanki do warunków in vitro (inicjacja kultury) – 4-8 tygodni.

a) Przygotowanie materiału roślinnego – wybór odpowiedniej części rośliny, wyizolowanie jej i dokładne umycie.

b) Sterylizacja – służy wyeliminowaniu drobnoustrojów z eksplantatu, ponieważ ich gwałtowny rozwój na bogatej pożywce zabije roślinę.

c) Umieszczenie tkanki na odpowiedniej pożywce (inokulacja, „wszczepianie”) – pożywka zazwyczaj zawiera wysokie stężenie cytokininy (hormon roślinny) pobudzającej wzrost komórek. Pierwsze kilka tygodni roślina „startuje”- pojawiają się nowe stożki wzrostu i wyrastają małe roślinki, bądź tworzy się tzw. kalus czyli guzowata narośl składająca się głównie z intensywnie dzielących się komórek merystematycznych, poprzeplatanymi bezładnie innymi typami komórek. Uzyskany w ten sposób materiał wykorzystamy w drugim etapie – namnażaniu.

2. Multiplikacja (proliferacja) – namnażanie – 3-4 tygodni.

a) Otrzymaną w punkcie 1 masę roślinną (kalus, małe roślinki, pojedynczą roślinę) dzieli się na części i umieszcza na pożywkach zawierających cytokininy, co powoduje dzielenie się roślin i ich dalszy wzrost. Punkt 2.a. powtarzamy do czasu osiągnięcia wymaganej przez nas liczby roślin.

3. Stabilizacja roślin w kulturach in vitro – 2 tygodnie.

a) Przenoszenie na pożywki wzrostowe – z pożywek multiplikacyjnych małe roślinki przenosi się na pożywki wzrostowe. Zawierają one najczęściej niewielkie ilości cytokinin i auksyn. Tutaj rośliny osiągają założoną wielkość, przestają się tak intensywnie dzielić i formują w pełni wykształcone organy.

b) Ukorzenianie rośliny (opcjonalnie) – rośliny przenosi się na pożywki z dużą zawartością auksyn (hormony roślinne)  indukującymi wzrost korzeni.

c) Stabilizacja roślin –  rośliny pasażuje się na pożywki zawierające węgiel aktywny, w celu wypłukania nadmiaru hormonów.

4. Wprowadzenie roślin do warunków niesterylnych (adaptacja hodowli do warunków  in vivo).

a) Wypłukanie nadmiaru pożywki  – dokładne wypłukanie nadmiaru pożywki z rośliny jest bardzo ważnym etapem ponieważ stanowi ona doskonałe środowisko do rozwoju mikroorganizmów, które mogą zaszkodzić rosnącej w glebie roślinie.

b) Posadzenie roślinek w odpowiednim podłożu i umieszczenie ich w zacienionej szklarni – wymagana jest zwiększona wilgotność ponieważ rośliny przez całe swoje życie rosły w blisko 100% wilgotności i muszą być przyzwyczajone do niższych jej wartości. Dodatkowo muszą „nauczyć” się korzystać z fotosyntezy ponieważ uprzednio wszystkie składniki odżywcze miały, można powiedzieć „podetknięte na talerzyku pod nos”, a teraz stopniowo należy im pokazać, że „życie wcale nie jest takie piękne”.

c) Hartowanie – stopniowe zmniejszanie wilgotności i zwiększanie intensywności oświetlenia.

d) Umieszczenie w docelowym miejscu hodowli.

Tak mniej więcej wygląda to zarówno w przemyśle jak i w warunkach amatorskich.

Cały proces mikrorozmnażania jest możliwy dzięki zjawisku totipotencji (totipotencja to zdolność do odtworzenia całego organizmu z pojedynczej komórki). Komórka musi mieć jednak nieuszkodzony materiał genetyczny i musi mieć zdolność do podziałów. W przypadku roślin większość komórek spełnia te warunki. Po odtworzeniu z pojedynczej komórki kalusa, bądź całej rośliny, dalszy podział indukowany jest za pomocą hormonów roślinnych – cytokinin. Powodują one wzrost komórek, hamują starzenie, powodują też wzrost uśpionych pędów bocznych. Kiedy osiągniemy określoną liczbę roślin, należy je ustabilizować. Auksyny powodują ukorzenianie się roślin, które rosną dalej na pożywkach wolnych od hormonów które zaburzałby wzrost roślin w warunkach in vivo. Bardzo ważna jest też stopniowa aklimatyzacja do warunków polowych (bez niej straty roślin byłby bardzo duże).

Laboratorium w kuchni

Pewnie w tej chwili do głowy przychodzi Tobie myśl: „chciałbym też spróbować, ale bez profesjonalnego laboratorium, sztabu naukowców i sprzętu za parę milionów złotych pozostaje mi wysiewanie nasion capensisów i modlenie się o to, by sadzonka ventraty się ukorzeniła”. Nic bardziej mylnego. Wielu ludzi, zwłaszcza w USA i krajach Europy zachodniej, również zajmuje się in vitro. Posiadają „wyspecjalizowane” laboratorium czyli kuchnię i wyszukany sprzęt w postaci mikrofalówki, kawałka kartonu oraz pęsetki do depilacji brwi. Nie jest to bynajmniej żart. Do założenia pierwszej kultury in vitro będzie potrzebne tylko kilka rzeczy których zdobycie to żaden problem.

Przejdźmy więc do konkretów. Co potrzebujemy?

1. Miejsce.

Jedną z ważniejszych rzeczy jest wybór odpowiedniego miejsca. Powinno ono zapewniać ograniczony ruch powietrza, być „miejscem spokojnym” gdzie nie mija nas co chwila po kilka osób. Potrzebujemy również blat który jest dość odporny lub nie będzie nam go szkoda zniszczyć. Osobiście polecam piwnicę, strych lub kuchnię.
 
2. Sprzęt.

• Miejsce do gotowania – elektryczna kuchenka grzejna, bądź gazowa. Będzie służyć do przygotowywania pożywek, oraz do ewentualnej pracy w warunkach sterylnych – technika pracy w parze wodnej (duży garnek przykryty siatką drucianą,  a w środku wrząca woda). Gorąca para wodna jest sterylna i zapewnia sterylną atmosferę w obrębie garnka.
• „Cleanbox”– najbardziej polecane miejsce pracy w warunkach sterylnych. Najprościej jest użyć akwarium bez jednej ściany, plastikowy pojemnik, karton wyklejony wewnątrz folią lub inne podobne konstrukcje. Rozważaniom na temat budowy cleanboxa będzie poświęcona osobna sekcja.
• Praca w cleanboxie polega na spryskaniu go wewnątrz etanolem, bądź alkoholem izopropylowym, odczekaniu kilku minut i unikaniu jakiejkolwiek cyrkulacji powietrza. Oddychamy na zewnątrz cleanboxa, w środku są tylko ręce.  Z tego powodu korzystne jest gdy górna powierzchnia jest przeźroczysta (może to być np.  rozciągnięta folia budowlana czy tafla szkła).
• Kuchenka mikrofalowa –  bardzo ułatwi nam pracę. Wykorzystamy ją  do przygotowywania sterylnej wody oraz ewentualnego przygotowywania pożywek.
• Półka hodowlana tzw. fitotron. Do zbudowania domowego fitotronu potrzebne będą 1-2 świetlówki o zimnym świetle (dające zwykłe białe światło). Umieszczamy je nad półką na której będziemy układać pojemniki z roślinami.

3. Dodatkowe akcesoria.

• Pojemniki hodowlane. Idealne są zwykłe słoiki. Można również używać wszelakich naczyń plastikowych. Polecam jednorazowe polipropylenowe pojemniki na żywność.
• Pęseta, nożyk, miseczki, talerze, słoiczki. Wszystko do znalezienia w kuchni.
• Palnik np. palniczek spirytusowy, palnik gazowy, w ostateczności palnik kuchenki gazowej.
• Pipetki, strzykawki o różnej pojemności. Zakupimy je w aptece i na Allegro.
• Waga elektroniczna z dokładnością 0,1-0.01g. Zakupimy ją na allegro w cenie 20-30zł
• pH metr, bądź papierki wskaźnikowe o zawężonym zakresie pomiarowym (zakres pH 5-7 bądź zbliżony).  Do kupienia w internecie.
• Butelki na roztwory.  Można wykorzystać np. plastikowe butelki (0,5 L ) po wodzie mineralnej.
• Spryskiwacz. Można użyć np. opakowanie po płynie do mycia szyb.

4. Odczynniki chemiczne.

• NaOCl –  podchloryn sodu . Roztwór wodny znajdziemy pod postacią wybielacza „ACE”. Idealnie nadaje się do sterylizacji materiału roślinnego.
• H₂O₂ (3%) – nadtlenek wodoru. To po prostu woda utleniona którą bez problemu kupimy aptece.
• Etanol – spirytus (drogi), denaturat, bądź skażony alkohol (do kupienia w sklepach chemicznych za niewielkie pieniądze).
• Detergent.  Możemy użyć mydła do mycia rąk, płyn do kąpieli, płyn do naczyń.
• Sacharoza – cukier spożywczy (popularny cukier do herbaty).
• Kwas solny, czysty wodorotlenek sodu/potasu. Można użyć ocet kuchenny i sodę kaustyczną  UWAGA! SUBSTANCJE SILNIE ŻRĄCE!.
• Pożywka hodowlana, agar, hormony, PPM, inne związki np. do sterylizacji. Do nabycia za grube pieniądze w firmach biotechnologicznych. W najbliższym czasie będą dostępne w dość niskiej cenie zestawy startowe dla amatorów, zawierające najtrudniejsze do zdobycia rzeczy – papierki o zawężonym pH, pożywki, hormony, PPM, NaDCC itp.

5. Odporność na porażki.

Najtrudniejsze do znalezienia w warunkach domowych ;) Praca w warunkach sterylnych wymaga dużo cierpliwości i spokoju, oraz wiele prób i błędów. Prawdopodobnie pierwsze 5-10 kultur które założycie skończą się niepowodzeniem. Nie należy się jednak poddawać :-)

Niedługo pojawią się osobne artykuły na temat zakładania własnego małego kuchennego laboratorium. Koszt podstawowych rzeczy których nie da się kupić w markecie lub nie ma ich w domu, wynosi około 150-200 zł. Jak widać nie są to duże koszta, a zainwestowane pieniądze mogą się bardzo szybko zwrócić np. ze sprzedaży rozmnożonych roślin. Dodatkowo obserwowanie wzrostu roślin na każdym etapie ich „drogi rozwoju” w kulturach tkankowych dostarcza bardzo dużo radości i satysfakcji ;)

Marrom